Biochemie der Pflanze

• Titel: Biochemie der Pflanze
• Autor: einsle
• Organisation: UNI GOETTINGEN
• Seitenzahl: 102

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Inhalt

• GP I Biochemie
• Biochemie der Pflanze Molekulare Strukturbiologie
• Göttinger Zentrum für Molekulare Biowissenschaften
• Versuch Aufreinigung Entsalzungssäule
• Versuch Charakterisierung HPLCAuswertung
• Versuch Aufreinigung DEAESäule
• Versuch DElektrophorese oder Particle Gun
• Versuch Aufreinigung SDSPAGE Gelfiltration
• Vesuch DElektrophorese oder Particle Gun
• Versuch Aufreinigung SDSPAGE Versuch Ultrafiltration Kristallisation
• Anmerkungen zur Protokollführung
• Abgabe der Protokolle
• Leistungsanforderungen des Praktikums
• Herstellung von Polyacrylamidgelen nach Laemmli Gellauf CoomassieFärbung
• Aufreinigung von nativer Lipoxygenase aus Sojabohnen
• Charakterisierung der Lipoxygenase aus Sojabohnen
• Rekombinante Expression von Lipoxygenase
• Proteinfällung mittels Trichloressigsäure
• Aufreinigung und Charakterisierung der rekombinanten Lipoxygenase
• Analyse der in Blättern exprimierten LipoxygenaseIsoformen durch DPAGE
• Transiente Transformation mittels Particle Gun
• Anlegen von SequenzDateien ProteinInformationsDatenblätter und Analyse charakteristischer Domänen
• Computergestützte Sequenzanalyse von Genen und Proteinen
• Arbeiten mit Proteinstrukturen
• Aufgaben Die Struktur der Lipoxygenase I
• Das kleine Malstudio
• Aufbau des Netzwerks Benutzerkonten
• Anhang II Arbeiten mit UNI Linux
• Anhang III Literatur
• Abb Die Lipoxygenasereaktion
•  Physiologische Substrate und Metabolite
• HO HOD or HOT
• Reductase or Glutathione LO
• R R O KOD or KOT
• HOO HPOD or HPOT
• Oxo fatty acid
• R HO O Ketole R
• EAldehyde O Ketole
• O Oxo phytodienoic acid
•  Reaktionsmechanismus und Struktur von Lipoxygenasen
• R H R H e OOH R
• Abb Katalysezyklus der Lipoxygenasen
• HC R Wasserstoffabspaltung
• HC R Radikalumlagerung
• O eH OOH HOO R COOH HC R
• O eH OOH R COOH
• Abb Modelle der Substratorientierung pflanzlicher Lipoxygenasen
• Proteinexpression und Reinigung
• Funktionelle Untersuchung von Proteinen
• Kristallisation von Proteinen und Strukturaufklärung
• Lösung des Phasenproblems
• Abb Flußdiagramm zum Ablauf einer röntgenkristallographischen Strukturaufklärung
•  Aufreinigung von nativer Lipoxygenase aus Sojabohnen
• Zeitplan für diesen Versuchsteil
• Rohextraktgewinnung Ammoniumsulfatfällung BradfordEichgerade Lösungen ansetzen
• Entsalzungssäulen Proteinbestimmung Aktivitätsmessungen Lösungen ansetzen
• Anionenaustauscher Proteinbestimmung Aktivitätsmessungen SDSPAGE
• Gelfiltration SDSPAGE Proteinbestimmung Aktivitätsmessungen
•  Aktivitätstest für Lipoxygenase
•  Proteinbestimmung nach Bradford
• Enzymeinheit U mol HPODEmin
• Lösung x für alle Gruppen ansetzen Aliquotnummer Bradford
• Tabelle Verdünnung in der Küvette
• Lösungen Je mM NaBoratpuffer pH mM NaBoratpuffer
• Lösung x für alle Gruppen ansetzen
• CH CH CH NH CH CH CH
• Abb Diethylaminoethyl DEAE
• Herstellung von Polyacrylamidgelen nach Laemmli
• M pH M pH mM pH
• Marker fertig Laufpuffer
• Protein Mol Weight Marker wwwfermetnascom
•  Charakterisierung der Lipoxygenase aus Sojabohnen
• pHOptimum der LO KM und vmaxBestimmung
• Bestimmung des pHOptimums der Lipoxygenase
• Enzymkinetische Untersuchung der Substratspezifität von Lipoxygenase
•  Bestimmung der Positionsspezifität von Lipoxygenase mittels HPLC
• Untersuchung der Temperaturstabilität von Lipoxygenase
•  Rekombinante Expression von Lipoxygenase
• Transformation der Plasmide
• Zellernte Aufschluß Inkubation des Lysates mit Säulenmaterial
• Affinitätschromatographie TCAFällung SDSPAGE Proteinbestimmung Aktivitätsmessungen
• KM und vmaxBestimmung Umsetzungen Extraktion HPLC
• Vektorkarte des pETaExpressionsplasmids der Firma Novagen
•  Kontrolle des Expressionsplasmids
• Größenkontrolle des Inserts durch Restriktionsverdau
• Abb Schnittstellen der benutzen Restriktionsenzyme
• Kontrolle des Inserts durch PCR
• LBMedim LBAgar Lysispuffer siehe Waschpuffer siehe Elutionspuffer siehe
• l x ml l ml ml
• Lösungen wird nur x für alle angesetzt
•  Transformation von E coli
• Antibiotikum Ampicillin Kanamycin Chloramphenicol Tetracyclin
• HO HO EtOH HO
• Stock mgml mgml mgml mgml
• Überexpression und Zellernte
• Bemerkung zB Induktion Ernte
• Stellen Sie das Bakteriumwachstum graphisch dar
•  Aufreinigung und Charakterisierung der rekombinanten Lipoxygenase
•  Sedimentation von Zelltrümmern
• Bestimmung der Positionsspezifität
• Isolierung von RNA
• mM TrisAcetat pH mM EDTA Glycerin Orange G
•  Analyse der in Blättern exprimierten LipoxygenaseIsoformen durch DPAGE
• ProteinSolubilisierung in IPGSolubilisierungspuffer
• Die Gesamtfokussierungszeit sollte bei insgesamt Voltstunden liegen
• SDSÄquilibrierung des IPGStreifens für die zweite Dimension
• SDSPAGE der DGelelektrophorese
•  Proteintransfer auf Nirocellulose
• AntikörperInkubationen und PeroxidaseNachweis
•  Transiente Transformation mittels Particle Gun
• Mittwoch Donnerstag Freitag
• Abbildung Aufbau des Particle Gun
• Abbildung Struktur des Green Fluorescent Protein
• Ultrafiltration Pipettieren der Kristallisationsansätze
• Beugungsexperimente Arbeiten mit Proteinstrukturen
• Kristallisation von Proteinen
• Dampfdiffusion im sitzenden Tropfen
• Pipettieren von Kristallisationsansätzen
•  KristallisationsScreening für Lipoxygenase
• KristallisationsScreening für Lysozym
•  Computergestützte Sequenzanalyse von Genen und Proteinen
• Anlegen von SequenzDateien
• ProteinInformationsDatenblätter und Analyse charakteristischer Domänen
•  BLASTAnalyse Suche nach Homologen der SojaLipoxygenase
• GenfamilienAnalyse der Lipoxygenasen in Arabidopsis thaliana
• Identifikation von Homologen
• Abkürzung AtLO AtLO AtLO AtLO AtLO AtLO
• Bearbeitung Student Student Student Student Student Student
• Größe in aa
• Sequenzanalyse der Mitglieder der Genfamilie
• Analyse konservierter Aminosäurenreste
• P Atg P L
• Zielsteuerungsanalyse der LipoxygenaseIsoformen von A thaliana
• Manuelle Untersuchung der chloroplastidären Zielsteuerung
• Expressionsanalyse der LipoxygenaseIsoformen von A thaliana
• Erstellung eines digitalen Expressionsprofils
•  Arbeiten mit Proteinstrukturen
• Die Protein Data Bank
• In diesem Jahr hinterlegte Strukturen Insgesamt bekannte Strukturen
• ATOM N HIS A N
• Hierbei bedeuten die einzelnen Spalten folgendes
• Die laufende Nummer des Aminosäurerests in der Polypeptidkette
• Das Programm PyMOL
• Grundlagen zum Arbeiten mit PyMOL
• Darstellung von Proteinen
• Oberflächen und Potenziale
• Berechnung von Oberflächen
• Berechnung von elektrostatischen Potenzialen
•  Aufgaben Die Struktur der Lipoxygenase I
• Arbeiten mit Linux
• Arbeiten mit der Protein Data Bank
• Informationen in der PDBDatei
• Die Struktur der Lipoxygenase I
• Proteinoberflächen und Oberflächenpotenziale
• Das Computernetzwerk der Molekularen Strukturbiologie
• Aufbau des Netzwerks
• Arbeiten mit UNI Linux
• Grafische Benutzeroberflächen KDE
• Die Verzeichnisstruktur von UNI Linux
• Arbeiten mit Kommandozeileninterpretern Shells
• pymol FNpdb ENTER
• ls auto junk mma tmp tmp
• ls a cshrc login auto junk mma
• ls F auto junk mma tmp
• ls aF cshrc login auto junk mma tmp
• ls mmaBriefe Suzidoc Suzidoc Suzidoc
• ls auto junk mma tmp
• Die Tilde ist ein Symbol für das HomeVerzeichnis
• steht für das übergeordnete Verzeichnis
• Wir begeben uns ins RootVerzeichnis
• ls F CDROM tmp scratch sally users
• Die Auflistung des RootVerzeichnisses
• ls F users jmo meb wds
• mv Suzidoc NeuerBriefdoc
• ls NeuerBriefdoc Suzidoc Suzidoc
• cp NeuerBriefdoc Suzidoc ls NeuerBriefdoc Suzidoc Suzidoc Suzidoc
• rm NeuerBriefdoc Suzidoc
• ls Suzidoc rm Suzidoc
• mkdir Make Directory Neues Verzeichnis
• ls F Suzidoc Test
• mv Test Test
• Existierende Verzeichnisse können wie Dateien umbenannt werden
• rmdir remove Directory Verzeichnis löschen
• mv Omadoc Test ls FR Test Test Suzidoc
• rmdir Test Test Directory not empty
• Ein Verzeichnis mit Inhalt kann nicht gelöscht werden
• rm Test rmdir Test
• pwd print working directory Zeige aktuelles Verzeichnis
• top table of processes Zeige laufende Prozesse
• Prozessnummer Besitzer CPULast Bisherige Laufzeit
• ps report process status Zeige die laufenden Prozesse
• Alle laufenden Prozesse
• Systemname der Festplatte
• Größe der Festplatte
• Freier Speicher Festplattenname
• Belegung der Festplatte in
• Zugriffsrechte unter UNI
• Mit ls können alle Rechte angezeigt werden
• chown wds dma
• chgrp user junk
• Ordne die Datei junk der Gruppe user zu
• rwxrwxr rwrr drwx
• cp stTAB star start starlog
• cd ENTER cd ENTER cd home
• setenv GRASP prosisigigraspaakda
• Setzen einer Umgebungsvariablen
• echo GRASP prosisigigraspaakdat echo history
• Abfragen der Umgebungsvariablen
•  TAB HOME HOST HOSTTYPE
• USERFILE SEARCHPATH term tty addsuffix uid
• alias dir binls pF
• dir auto ffr junk kristalle test
• alias colours cedit
• Weitere nützliche Befehle
• which identifizierelokalisiere einen Befehlein Programm which ls sbinls
• grep ATOM FNpdb
• find name a print
• Ein Skript kann einfache Bedingungen enthalten
• if SIZE setenv DIM
• oder komplziertere Entscheidungen
• if SIZE goto SizeIsOne
• Ressourcen zu UNI im Internet
•  Anhang III Literatur

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